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　　! 第五章 荧光检测器及检测方法 )’( 第五章 荧光检测器及检测方法 许多化合物有光致发光现象。化合物受到入射光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波长 长的特征辐射。当入射光停止照射时，特征辐射也很快地消失，这种辐射光线就是荧光。整个 电磁波范围内都可能产生这种辐射。液相色谱中的荧光检测器仅使用吸收紫外光或可见光而 发射的荧光。利用测量化合物荧光强度对化合物进行检测的液相色谱检测器就是荧光检测器 （ ）。 !# 第一节 工作原理和仪器结构 一、工作原理 （一）荧光的产生 从电子跃迁的角度来讲，荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后，原 子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。 图$ % % ’ 光能的吸收、转移和发射示意图 ! $! 第四篇 液相色谱检测方法 电子在同类分子或其它分子中撞击，消耗了相当的能量，从而下降到第一电子激发态中的 最低振动能级，能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。由最低振动能级下降到基态中的某些 不同能级，同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光（图! # $ ）。被化合 物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光的波长总要比分子吸收的紫外光波长 长，通常在可见光范围内。荧光的性质与分子结构有密切关系，不同结构的分子被激发后，并 不是都能发射荧光。 （二）定量基础 在光致发光中，发射出的辐射量总依赖于所吸收的辐射量。由于一个受激分子回到基态 时可能以无辐射跃迁的形式产生能量损失，因而发射辐射的光子数通常都少于吸收辐射的光 子数，这里以量子效率 来表示：在固定的实验条件下，量子效率是个常数。通常 小于 ， ! ! $ 对可用荧光检测的物质来说， 值一般在 之间。荧光强度 与吸收光强度成正比： ! %$ ’ %( （ ） （ ） ) ! #% # ! # $ 其中， 为入射光强度，为透射光强度， 即为吸收光强度。透射光强度可由朗伯 比耳 #% # #% # 定律求得： #% $ ) % ) *+ ! # -.%. % ! # ) #% , 因此 -.%. % （ ! ） （ ） ) !#% $ , ! # - 当被分析物浓度足够低时（吸光度/ %%#），上式可简化为 （ ） ) -.%. !# % ! # . % ! 由于在实验室用仪器中，总发光量仅有某一确定的部分被检测器收集检测，当考虑了荧光 收集效率 后： ’ -.%.’!# （ ） ) % ! # ! % ! 由上式可见，对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入 射光强度、荧光的量子效率及荧光的收集效率等成正相关。在其它因素保持不变的条件下，物 质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比。这是荧光检测器的定量基础。荧光检测器属于浓度 敏感型检测器，可直接用于定量分析。但是，与使用紫外 可见光检测器时一样，由于各种物 质的 和 数值不同，在定量分析中，不能简单地用峰高或峰面积的归一化法来计算各组分 ! ! 的含量。 （三）激发光谱和发射光谱 荧光涉及光的吸收和发射两个过程，因此任何荧光化合物，都有两种特征的光谱：激发光 谱（67,829:;）和发射光谱（,;166145 67,829:;）。 荧光属于光致发光，需选择合适的激发光波长（( ）以利于检测。激发波长可通过荧光化 0 合物的激发光谱来确定。激发光谱的具体测绘办法是通过扫描激发单色器，使不同波长的入 射光激发荧光化合物，产生的荧光通过固定波长的发射单色器，被光检测元件检测。最终得到 的荧光强度对激发光波长的关系曲线就是激发光谱。在激发光谱曲线的最长处，处于激 ! 第五章 荧光检测器及检测方法 *,$ 发态的分子数目最多，即所吸收的光能量也是最多的，能产生最强的荧光。当只考虑灵敏度 时，测定时应选择最大激发波长。 一般所说的荧光光谱，实际上仅指荧光发射光谱。它是在激发单发器波长固定时，发射单 色器进行波长扫描所得到的荧光强度随荧光波长（即发射波长， ）变化的曲线。荧光光谱可 ! ! 供鉴别荧光物质，并作为在荧光测定时选择合适的测定波长的依据。 图 # $ # % 是奎尼定的激发和发射光谱。 另外，由于荧光测量仪器的特性，例如光源的能量分布、单色器的透射率和检测器的响应 等性能会随波长而变，所以同一化合物在不同的仪器上会得到不同的光谱图，且彼此间无类比 性，这种光谱称为表观光谱。要使同一化合物在不同的仪器上能得到具有相同特性的荧光光 谱，则需要对仪器的上述特性进行校正。经过校正的光谱称为真正的荧光光谱。 激发波长和发射波长是荧光检测的必要参数。选择合适的激发波长和发射波长，对检测 的灵敏度和选择性都很重要，尤其是可以较大程度地提高检测灵敏度。图 # $ # 是反相色 谱分离多核芳烃的色谱图。两张色谱图的分离条件相同，只是在荧光检测时选择了不同的激 发和发射波长，从 （激发波长） （发射波长）到 ，许多组分的灵敏度都 ’(! ) %$(! *(!+$(! 得到改善。由于不同化合物的适合检测的激发波长和发射波长不同，为了在一次色谱分析中 对不止一种化合物的检测有利，当前的荧光检测器多具有波长程序功能。 图 # $ # % 奎尼定的荧光激发和发射光谱 二、仪器结构 根据化合物发生荧光的条件和对化合物荧光强度检测的要求，普通的一台荧光检测器包 括以下基本部件：激发光源；选择激发波长用的单色器；流通池；选择发射波长用的单色器及用 于检测发光强度的光电检测器。 由光源发出的光，经激发光单色器后，得到所需要的激发光波长。激发光通过样品流通 池，一部分光线被荧光物质吸收。荧光物质激发后，向四面八方发射荧光。为了消除入射光与 散射光的影响，一般取与激发光成直角的方向测量荧光（直角光路）。荧光至发射光单色器分 光后，单一波长的发射光由光电检测器接收。 ! /!/ 第四篇 液相色谱检测方法 （一）基本结构 ! 光源 由于荧光强度与激发光强度成正比，因此理想的激发光源应具备： 足够的强度； 在紫 ! 外 可见光区有连续光谱； 光源强度与波长无关，也就是说光源的输出应有连续平滑等强度 # # 的辐射； 光强稳定。 $ 图$ # % # 反相液相色谱分离，荧光检测多核芳烃 （） （ ） （ ）；（ ） （ ） （ ） ’ $()* ! , $-%)* ! . /)* ! 0$%)* ! + * + * —蒽；—荧蒽；— 甲基蒽；—芘；—苯并［ ］蒽；—苯并［ ］芘；—苯并［ ，，］芘 ! - ! # $ % / 1 # $ % 早期荧光检测器采用激发光光强较强的高压汞蒸气灯、镉灯和锌灯等光源，但这些灯为线 性光源（光谱线：汞灯——— ， ， ；镉灯——— ， ；锌灯——— ， -%$)* /%)* $(%)* --2)* -/)* -!$)* ， ），不能满足各种组分不同激发波长的要求。现在较多使用能发出 (3)* %)* --()* 4 /%()* 连续光谱的氙弧灯，发射光强度大，而且在(()* 4 $(()* 波段内，光谱强度几乎相等，但在波 长小于-3()* 时，光强迅速下降。虽然大功率氙弧灯在紫外区输出功率大，但在稳定性和热效 ! 第五章 荧光检测器及检测方法 7%8 应方面还存在不少问题。采用脉冲放电氙灯，提高了低波长紫外区的灵敏度，而且可避免由于 流通池升温引起的基线漂移。目前已有许多氙弧灯不再采用高压放电方式。脉冲激发光源可 以有不同的脉冲频率选择，如 、 ，有利于延长光源的使用寿命。在增强频率时，更适 !#$ %#$ 用于超痕量样品的检测。还有的荧光检测器采用氙 汞弧灯，虽然可克服氙弧灯的缺点，然而 其光谱输出的平滑度远不如氙灯。 高功率连续可调激光光源是一种新型的荧光激发光源。激光光源单色性好，强度大，可提 高荧光检测器的灵敏度和选择性，缺点是成本高，波长范围小。 !’ 激发光和发射光单色器 荧光检测器的光学系统由光学透镜和单色器组成。光学透镜可分为聚光透镜和荧光收集 透镜。聚光透镜的作用是将激发光束准确地聚焦在检测池窗口上，荧光收集透镜是采集一定 角度的发射光于光电检测器上。 激发光和发射光单色器的主要作用都是提供单色光。激发光单色器位于光源和流通池之 间，能为样品激发提供单色光，又称第一单色器；发射光单色器置于流通池和检测器之间，作用 是提供适合检测的单色荧光，又称第二单色器。单色器的不同是荧光检测器分为多波长荧光 检测器和荧光分光检测器两大类的主要依据。多波长荧光检测器用若干个滤光片作单色器， 因此又称为固定波长荧光检测器。荧光分光检测器采用光栅作单色器，选择激发光波长和发 射光波长。与固定波长检测器相比，荧光分光检测器能进行光谱的自动扫描。 单色器在荧光分析的灵敏度和选择性方面存在着相互制约的因素。窄光谱带的选择性 好，但窄谱带仅占发射光谱的一小部分，灵敏度低。单色器的光谱带是由其色散能力和狭缝宽 度决定的。单色器一般都有进出光两个狭缝，出射光的强度与单色器狭缝宽度的平方大约成 正比，增大狭缝宽度有利于提高信号强度，缩小狭缝宽度有利于提高光谱分辨率，但要以信号 强度的牺牲为代价。 多波长荧光检测器用短通路剪切式滤光片或宽带的光通带滤光片插在光源与流通池之 间，作为激发滤光片（第一滤光片）限制最大激发波长。长通路剪切式滤光片或通带滤光片作 为发射光滤光片（第二滤光片），插在流通池和检测器之间。通过发射光滤光片的波长上限应 小于通过激发光滤光片的波长下限。滤光片单色器价格低，操作简单，但选择性不强，而且还 要经常根据波长选择的需要更换滤光片。 现在一般都采用光栅作为荧光检测器的单色器。光栅单色器与滤光片单色器相比，优点 是： 具有光谱扫描功能； 分辨率高。缺点是： 仪器结构不够紧密； 灵敏度低； 成本高。 ! ! # 光栅单色器有两个主要性能指标，即色散能力和杂散光水平。色散能力通常以每毫米狭 缝宽度的光谱波长纳米数来表示（() * ))）。对于一般荧光检测器来说，因为荧光化合物的荧 光峰宽度很少小于 ，单色器的分辨率不是主要问题。荧光分光检测器多选用闪耀波长（光 +() 栅输出最强光的波长， ）落于紫外区的光栅为激发单色器，以弥补氙灯紫外区能 ,-.$/ 0.1/-/(234 量弱的缺点。由于荧光化合物的荧光多数落在5() 6 7() 区，因而发射单色器常采用闪 耀波长为+() 左右的光栅。在闪耀波长处，光栅色散效率最高，对固定的狭缝宽度，荧光检 测的分辨率也最高。闪耀波长两边，色散效率呈下降趋势。 对于荧光测量来说，单色器杂散光水平是一个极关键的参数。杂散光被定义为除去所需 要的波长的光线以外，通过单色器的所有其它光线的强度。荧光化合物的荧光一般都很弱，通 过激发单色器的长波长的杂散光容易被当作荧光来检测。许多生物样品有较大的浊度，结果 ! 928 第四篇 液相色谱检测方法 入射的杂散光被样品散射而干扰荧光强度的测量。另外，在荧光分析中，还常遇到来自溶剂和 流通池材料的瑞利散射光（!#$%’( )*++%! ）、被流通池内表面反射和折射的激发散射光、来自溶 剂的拉曼光以及杂质产生的荧光干扰。前两种散射光的波长与激发光的波长相同，相对较容 易去除，而拉曼光由于波长比一般激发光波长长，更接近荧光化合物的波长。散射光和拉曼光 对荧光背景的贡献，常常成为荧光分析方法灵敏度的主要限制因素，因而通常选用低杂散光的 单色器。光栅去除杂散光的能力一般要好于通带滤光片。为了进一步去除杂散光，有的荧光 分光检测器在使用光栅做发射单色器的基础上，还要附加截止滤光片，起到双重减少干扰的作 用。 ,- 流通池 用于液相色谱检测的荧光检测器与一般荧光光度计的主要区别在于流通池。实际上任何 类型的荧光计，无论是光电荧光计还是分光荧光计，只要安装合适的流通池，都可用作液相色 谱的荧光检测器。唯一的限制是液相色谱检测要求的是小于.-/) 的响应时间。 流通池的宽度 （即光程长）是影响吸收型检测器灵敏度的重要因素。理论上 越大越 ! ! 好，但实际上 受到流通池体积引起的峰展宽的限制。荧光检测器流通池的设计原则是在尽 ! 量减小峰展宽的条件下，产生最大的荧光信号。从定量公式可以看出，荧光强度的影响因素 多，对灵敏度的影响不如吸收型检测器大，而流通池体积小，则有利于降低峰展宽。常见的 ! 流通池体积为/ 0 1 2/ 0。 ! ! 图3 4 / 4 3 流通池光路示意图 （）吸收型；（ ）荧光型 5 图3 4 / 4 3 是吸收型检测器和荧光检测器的流通池光路图。两者的相同之处是入射光光 轴和流动相流动方向一致。不同的是，荧光检测器还需第二光轴：发射光轴。按入射光轴与发 射光轴之间呈现的角度，荧光检测光路可分为直角光路（ ），直通光路（ ），反射光路（ ） 6.7 28.7 .7 和轴向光路（其它角度）。最普通的测量发射辐射的做法是与激发辐射呈直角，并对准流通池 的中心部位进行测量。直角光路因对从光源来的直射光的干扰不敏感，得到的信噪比较好。 直通光路可用标准的紫外吸收池，但必须仔细选择滤光片，以防杂散光到达光电检测器。否 则，将得到很高的荧光本底，信噪比较差。与直角光路比，直通光路虽然对光源来的直射光的 干扰敏感，但荧光收集效率高。图 （）是第三种类型的检测器。反射池与凹面透镜组 3 4 / 4 / ! 第五章 荧光检测器及检测方法 4 合在一起。池背面反射光，防止激发光通过池到达光电检测器。凹面镜集聚散射荧光，从流通 池射出并聚焦在光电检测元件上，增强了荧光收集效率，而且减少了内滤效应，检测限得到提 高。在 柱上，信噪比为 时，蒽的检测限为 。具体的流通地结构如图 !#$%’’ ( )*’’ + ,%#-. $ （）。 / * / * 0 图$ / * / * 凹镜式荧光检测器 （）光路图；（ ）流通池结构 1 0 —入射光束；—池体；—光学镜；—池腔（ ）；—室杆；—发射光束 ) + $ * 2 * ! 圆柱形石英池和直角形石英池在荧光检测器中都有应用。直角形流通池仅能用于与激发 辐射的光路成 、 和 的角度上对发射辐射所进行的测量。以其它角度测量，在检测器 ,3 4,3 #,3 方向上的发射辐射都将有不可忽略的一部分被池壁反射。图$ / * / 是一种圆柱形流通池的 结构图。 图$ / * / 圆柱形流通池 ! BA$ 第四篇 液相色谱检测方法 ! 光电检测器 荧光检测器一般采用光电倍增管作为检测元件。光电倍增管是一种很好的电流源，在一 定条件下，其电流量与入射光强度成正比，不仅起着光电转换作用，而且还具有电流放大作用。 由于光电倍增管具有灵敏度高———电子放大系数可达 % ’ ，线性响应范围宽———光电流 #$ #$ 在#$( % ) #$ ( * ) 范围内与光通量成正比，响应时间短（#$( ’ + ），已成为分析仪器中最常用的检 测元件。用光电倍增管做检测器时，可用模拟型和计数型两种方法检测。当信号较弱时，需取 多次扫描的平均值来提高信噪比，采用光子计数型检测。光子计数型有较高的检测灵敏度和 稳定度。对于相对较大的信号，模拟型检测的线性好，测量精度高。光电倍增管的灵敏度受暗 电流限制，暗电流主要由阴极和二次发射极的热电子发射和电极间的漏电形成。不同型号的 光电倍增管，由于所用的光阴极光敏材料不同，其光谱响应特性也不同，适用于不同的波段。 由于单色器和光电倍增管的非理想化光谱响应，发射光谱会产生歪曲，如前所述，要获得真实 的发射光谱就必须进行校正。 图! ( , ( - 混合物的色谱图 荧光分光检测器和紫外分光检测器一样，可以自动扫描获得全光谱。对未知物检测来说， 获取全光谱用于定性是重要的。另外，全光谱的获取还有利于提高灵敏度和共淋洗组分的光 谱分辨。最早的是用普通的扫描荧光计，停流扫描，但该方法会引起峰展宽。最好的办法是在 色谱正常淋洗时间内实现快速扫描。采用快速机械扫描的办法，多数情况下会遇到再现性和 信噪比损失的问题，采用多通道检测技术的荧光检测器取代振荡镜扫描荧光计，实现了光谱的 快速自动扫描。多通道分析器（ ， ）主要包括采用光导摄像管 ./01234 4 3834:;9 =) （ ）和光电二极管阵列作为检测器的两种类型。多通道检测技术的特点是采用多色光照 ?1@12.8 射样品，用光导摄像管或光电二极管阵列检测荧光信号，通过计算机处理，得到荧光强度同时 随发射波长和时间变化的关系图谱，即三维荧光光谱（图! ( , ( - ）。光导摄像管常用硅强化 ! 第五章 荧光检测器及检测方法 1/’ 靶（ ）， 与光电倍增管相比，灵敏度低一些。为此可采用傅立叶变换滤波的数据平滑技 !# !# 术，以减弱噪音的影响。 采用光栅色散，将多色光分散到几百个光电二极管的 结上， !# $ % 每个二极管对应一个特定的波长，通过连续的电子束扫描检测每个二极管上信号的大小。入 射辐射落到这些二极管上，引起电荷的损失，由电子束重新充电的电流正比于辐射的强度。光 电二极管阵列检测器的工作原理与 相同，与 比较，它在紫外区有较好的工作特性，故商 !# !# 品荧光检测器多采用光电二极管阵列检测。多通道检测技术可以在很短的时间内（小于’(） 一次实现全光谱扫描，为色谱分析提供更多的信息。例如利用计算机谱库检索，帮助鉴定荧光 化合物；纯度检测；多波长、多通道同时检测等。 （二）常用的荧光检测器 越来越多的液相色谱分析采用荧光检测，荧光检测器同传统的紫外 可见吸收检测器一 % 样容易使用、操作和维护。荧光检测器为自然荧光化合物和同荧光试剂反应形成稳定荧光物 的化合物的检测提供了高灵敏度和高选择性。前面介绍过，荧光检测器按单色器的不同可分 为固定波长荧光检测器和荧光分光检测器。除此之外，按有无参比光路的不同，荧光检测器又 可分为单光路荧光检测器和双光路荧光检测器。 图) % * % + 是一种双光路固定波长荧光检测器。中压汞灯发出的连续光经半透半反射镜 分成两束，分别通过样品池和参比池。半透半反射镜将 ’,-左右的激发光反射在参比池及相 应的光电倍增管上。参比池有利于消除外界的影响和流动相所发射的本底荧光，参比光路有 利于消除光源波动的影响。 左右的激发光经激发光滤光片分光后，选择特定波长的光线 .,- 作为样品激发光。该光束经第一透镜聚光在样品地入口处，样品池内的组分受激后发出荧光。 取与激发光成直角方向的荧光，由第二透镜将其会聚到发射滤光片。在光电倍增管之间有一 个电压控制器，由参比光电倍增管输出电压讯号控制样品光电倍增管的工作电压。当光源变 强时降低工作电压，光源减弱时升高工作电压，补偿了光源强度的波动对输出信号的影响。 图) % * % + 荧光检测器示意图 —中压汞灯光源；— 反射棱镜；—激发光滤光片；—透镜；—测量池； ’ / ’,- 0 ) * —参比池；—发射光滤光片；—光电倍增管；—放大器； —记录器； 1 2 + . ’, —光电管； —对数放大器； —线性放大器 ’’ ’/ ’0 ! *)) 第四篇 液相色谱检测方法 如将滤光片换为光栅，光路稍做调整，这种结构就是荧光分光检测器（图! # $ ）。许多 荧光分光检测器具有光谱扫描功能，通过微处理器控制驱动马达，带动反射镜或光栅移动，可 以直接获得未知物的激发或发射光谱。加上波长程序功能，对复杂多组分化合物的每一组分 的最佳激发和发射波长进行编程，一次进样可获得各个组分的最大响应值。为进一步提高检 测灵敏度，一些荧光分光检测器已改进了光路设计，例如为减少反射损失，不使用透镜聚光，单 色器为装在密封套中的全息凹面衍射光栅及球面镜等。 图! # $ 双光栅单色器荧光分光光度计 三、荧光化合物的检测 在荧光化合物的高灵敏度检测中，获取检测的最佳激发波长和发射波长是至关重要的。 如果没有其它因素的干扰，荧光化合物的最佳激发和发射波长可以通过该化合物的激发和发 射光谱获取，而且荧光化合物的激发和发射光谱能提供一定的定性依据。但是，在液相色谱的 分离检测过程中，还不能做到对色谱峰的激发和发射光谱的在线采集。 对于复杂组分的测量，为了获得最灵敏的检测，可以采取的办法是使用具有光谱扫描功能 的荧光分光检测器，两次进样。第一次进样、激发波长选在低波长% 区，发射波长为一个光 谱范围。大多数荧光化合物在低波长 % 区有较强的吸收，此波长下收集发射光谱已够用。 例如：在 ，一次进样 种多核芳烃（ ）混合物，采集 为 的所有 ! ( )*+,- .# /01 ! 2++,- 3 *++,- ’ - 化合物的发射光谱。从这些化合物的发射光谱，可以确定检测的最佳发射波长时间程序。第 二次进样是在确定的最佳发射波长时间程序下，采集所有化合物的激发光谱，结果用于确定合 适的激发波长。两次进样结果，使操作者获得了最佳检测条件。 另外，对于大多数有机化合物，从二极管阵列检测器获取的% 光谱与其荧光激发光谱很 相近。两种光谱的区别主要由检测器特性如光谱分辨率，或者光源等因素引起。实际上，这种 区别常常可以忽略。因此，采取光电二极管阵列检测器与荧光检测器串联使用的方法，由二极 管阵列检测器得到% 光谱和荧光检测器得到的荧光发射光谱，一次进样就可以获取一系列 化合物的最佳激发和发射波长。 在氨基甲酸酯的质量控制中，需要分析杂质 ， 二氨基吩嗪（ ）和 氨基 羟基 ) 2 41/ ) 2 ! 第五章 荧光检测器及检测方法 B8@ 吩嗪（ ）的含量。用 和 检测器可以采集两种杂质的标准样品的 光谱和发射光 !# $!$ %$ ’( 谱，图 是 的光谱图，可以看出 的 光谱与其荧光激发光谱很相近。图 ) * + * ,- $!# $!# ’( ) * + * ,, 是在不同激发波长下得到的色谱图。 图 的 和荧光光谱 ) * + * ,- $!# ’( 在日常分析中，基体会严重干扰样品的测定。波长时间程序常被用来提高选择性和检测 灵敏度，但在复杂基体样品分析时，由于化合物的保留值相近，波长的改变常会造成定量不准 和保留时间变化。使用多通道（多波长）的同时采集色谱流出信号，能够得到高选择性、高灵敏 度的准确检测结果。例如， 系列的 能同时四通道采集色谱峰。以前只有质谱和光 #,,-- %$ 电二极管阵列检测器具有谱库检索功能，荧光检测器的现代发展也提供了峰识别和纯度检验 功能。利用标准荧光化合物的激发光谱和发射光谱建立的谱库，峰的确证更加容易、可靠。 图) * + * ,, 不同激发波长下色谱图比较 柱： ， ， ， ；流动相： ./0123 45 +-66 7 866 #9! + 6 ! 水， 乙腈； ， ； ， ；流速： ；室温： ! : 5 : -6; += 5 ,-6; ,+= 5 -)6 ? 6; @+A ! -,* 第四篇 液相色谱检测方法 第二节 荧光检测器的特点和适用范围 一、荧光检测器的特点 ! 荧光检测器的优点 灵敏度极高。荧光检测器的灵敏度比紫外 可见光检测器的灵敏度约高两个数量级， ! # 最小检测量可达 # !% 。这是因为在紫外吸收检测法中，被检测的信号 （ ），即当样 !$ ! ’ ( ) $ 品浓度很低时，检测器所检测的是两个较大信号 及 的微小差别；而在荧光检测法中，被检 $ 测的是叠加在很小背景上的荧光强度。荧光检测器是最灵敏的液相色谱检测器，特别适合于 痕量分析。愈是常用的衡量检测器灵敏度的基准物质。另外，荧光检测器的灵敏度还可以用 水的拉曼谱带的信噪比来衡量。 良好的选择性。产生荧光的一个必要条件是该物质的分子具有能吸收激发光能量的吸 收带，即物质分子具有一定的吸收结构；另外的条件是吸收了激发光能量之后的分子具有高的 荧光效率。相对较少的分子具有大的足够检测的量子效率是荧光检测器高选择性的主要原 因。在很多情况下，荧光检测器的高选择性能够避免不发荧光的成分的干扰，成为荧光检测的 独特优点。图 中虽然紫外 可见光检测器在 可以检测牛奶中的维生素 ，但 * # + # !, # ,-+./ 0 , 却取激发波长,-+./，发射波长+,$./ 做荧光检测。因为基体成分在此条件下不存在干扰荧 光，具有更准确的检测结果。 图* # + # !, 12 和345 检测20 , 线性范围较宽。线性范围约 * + ，虽然比紫外吸收检测器窄，但对大多数痕量分 # !$ 6 !$ 析，该线性范围已足够宽。在分析物质浓度较大时，发射强度由于内滤效应可能随浓度增加而 降低。 $受外界条件的影响较小。 %只要选作流动相的溶剂不会发射荧光，荧光检测器就能适用于梯度洗脱。 第五章 荧光检测器及检测方法 9!3 其中，荧光检测器的极高灵敏度和良好选择性是它最大的优点，因而在某些领域如药物和 生化分析中起着不可替代的作用。 ! 荧光检测器的缺点 荧光检测器的高选择性优点在一些情况下，也是该检测器的缺点。因为不是所有的化合 物在选择的条件下都能发生荧光，所以荧光检测器不属于通用型检测器，与紫外 可见光检测 # 器相比，应用范围较窄。 对通常发生在荧光测量中的一些干扰非常敏感，如背景荧光和猝灭效应等。虽然这些干 扰在液相分析中不经常遇到，但在进行定量分析时，有必要验证这些干扰是否存在，以及对样 品测定的影响程度。尤其对某些物质，如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物等，都应 予以特别注意。 二、荧光化合物及影响荧光强度的因素 （一）荧光化合物 为了使用荧光检测器对化合物进行有效的检测，应当了解化合物的结构与发生荧光的关 系。 具有对称共轭体系的分子能发射荧光。荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的! 电子共轭体系的分子中，并且随 电子共轭度和分子平面度的增加，荧光效率增大，荧光光谱 ! 向长波方向移动。 具有芳香环并带有给电子取代基的化合物，或具有共轭不饱和体系的化合物都能发出荧 光。在芳香烃上导入给电子基团，如— ，— ，— ，— 等均增强了荧光，主要是由 $% % $’% ) ! ( ! 于产生了 共轭作用，在不同程度上增强了 电子的共轭。而吸电子基团如— 、— * # ! ! $ ! ’$$% 等减弱了荧光。取代基位置对芳香烃荧光的影响通常为：邻位、对位取代增强荧光，间 位取代抑制荧光。 *% 值对可离子化的某些荧光化合物的影响很大。例如未解离的苯酚和苯胺分子会产生 荧光，但其离子却不产生荧光。苯酚在*% + , 的溶液中荧光最强，而在*% + ,( 的溶液中无荧 光；苯胺在*% 为- . ,! 的溶液中能产生荧光，而在*% / ! 和*% 0 ,( 的溶液中都不产生荧光。 ! # ! # ! % % ! ! 1 $% ! ! $% ! ! # ! % #$ ! % #$ ! % ( ! % 1 % 1 *% / ! *% + - . ,! *% 0 ,( 无荧光 蓝色荧光 无荧光 一些化合物的化学结构与荧光的关系见表2 # 3 # , 。 表2 # 3 # , 分子结构和离解与荧光的关系 发生荧光的结构 不发生荧光的结构 ) + $% ) + %， ， $ ’$$% ) ) ! + $) ! ! ! ! ! ! ! ! + 烷基 ! + % ! ! ! ! ， ， + ’5 67 8 + 4 # $ )) 第四篇 液相色谱检测方法 续表 发生荧光的结构 不发生荧光的结构 ! !# ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! $ % ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !# ! !# !# ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 和 ! ! ! ! ! ! ! ! !# ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 和 ! ! ! ! ! ! # $ $!! $ $!! $ $!!# # # $ $—$!! $ $ $!! $ $—$!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 和 ! ! ! ! ! ! !# !# ! !# ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !! !! !! !! ! ! ! ! ! ! ! ! # ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ( ( ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! $ $’ $!! $ $’ $!! $ 第五章 荧光检测器及检测方法 )( 续表 发生荧光的结构 不发生荧光的结构 !!# !!# ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! # ! !# #! !# $ $ !# !# $ %# %#’ $ ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! %# %!# $ ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !

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